Курс лекций "Белковая инженерия"

Для студентов 5-го курса ФББ МГУ


Новости

[2019-01-09] Добавлен файл со списком вопросов для подготовки к экзамену

[2018-12-25] Добавлены файлы презентаций лекций 11 и 12, прочитанные 25 декабря

[2018-12-18] Последняя лекция курса состоится 25 декабря по расписанию (т.е. начнется в 15:35)

[2018-12-18] Добавлен файл презентации лекции 10, прочитанной 18 декабря

[2018-12-18] Финальную версию презентации и, в случае необходимости, поясняющего сопроводительного текста, подготовленных по результатам самостоятельной работы в группе на выбранную тему, необходимо прислать мне на почту по 30 декабря (последнее воскресенье 2018 года). Титульный слайд презентации должен содержать список студентов, участвовавших в работе, с описанием вклада каждого студента.

[2018-12-14] По договоренности с учебной частью лекция 18 декабря начнется в 10:55 и пройдет, как обычно, в 221 ауд.

[2018-12-11] Добавлены файлы презентаций лекций 8 и 9, прочитанные 11 декабря.

[2018-12-10] Лекция 11 декабря пройдет по расписанию, т.е. с 15:35 до 17:10.




Список вопросов для подготовки к экзамену

Список вопросов: [скачать]

Вопросы сформулированы в рамках прочитанных лекций. Для удобства формулировки даны максимально подробно в соответствии с тем, как вопрос был представлен на лекциях. Для подготовки используйте конспекты лекций, файлы презентаций, а также дополнительные материалы в виде статей, ссылки на которые представлены на сайте в соответствующих разделах.




Учебные материалы

  • Suplatov, D., Voevodin, V., & Švedas, V. (2015). Robust enzyme design: Bioinformatic tools for improved protein stability. Biotechnology journal, 10(3), 344-355 скачать;

  • Суплатов Д. А., Швядас В. К. (2015) Изучение функциональных и аллостерических сайтов в суперсемействах белков. Acta Naturae, 7 (4), 39–52 скачать;

  • Suplatov D., Kirilin E., & Švedas V. (2016) Bioinformatic Analysis of Protein Families to Select Function-Related Variable Positions. In Understanding Enzymes Function, Design, Engineering, and Analysis (Eds. Allan Svendsen), Pan Stanford, pp. 351–385 скачать;

  • Suplatov D.A., Kopylov K.E., Popova N.N., Voevodin Vl.V., Švedas V.K.(2018) Mustguseal: a Server for Multiple Structure-Guided Sequence Alignment of Protein Families. Bioinformatics, 10.1093/bioinformatics/btx831;



Презентации лекций




Темы для самостоятельной работы в группах

Для выполнения самостоятельной работы необходимо проанализировать актуальную научную литературу, опубликованную в ведущих изданиях за последние 5 лет. Уточнение: имеется ввиду не всю литературу за 5 лет, а выбранные статьи, которые были опубликованы недавно, т.е. не являются однозначно устаревшими, посвящены актуальным задачам, и реализуют современную компьютерную и экспериментальную методологию. Список тем и комментарии к ним приведены ниже. Красным выделены темы, которые уже закреплены за конкретными группами. Зеленым выделены темы, которые остаются свободными.

  • Тема 1: Стохастические подходы в современной белковой инженерии. Комментарий к теме: Использование методов компьютерной биологии, статистики, а также современных экспериментальных подходов, в том числе роботизированных систем скринирования, позволило значительно повысить эффективность "направленной эволюции". Тем не менее, последние десят лет ученые всего мира говорят о последовательном отказе от стохастических методологий и переходе к более рациональным стратегиям, основанным на большем понимании механизмов действия белков/ферментов. Необходимо проанализировать современную литературу и обосновать закат стохастических методологий в белковой инженерии.

  • Тема 2: Аллостерия в современной белковой инженерии. Комментарий к теме: Феномен аллостерии известен более 50 лет, однако именно в последние ~10 лет по нарастающей усиливается научный и прикладной интерес к этой теме – почему? На это есть две основные причины. (1) Первые модели MWC и KNF описывали аллостерию как кооперативность, свойство больших, многомерных, сложно устроенных белковых комплексов, например, гемоглобина или ГАФД. При этом разных центров, как таковых, не было – субстрат/кофактор, связавшись в активном центре первой субъединицы оказывал влияние на свойства активного центра в остальных субъединицах, т.е. один активный центр был аллостерическим для других активных центров, а регуляторным агентом был основной субстрат/кофактор. С тех пор было накоплено достаточное количество примеров, чтобы сделать следующие выводы: аллостерия - это не только кооперативность, свойственная мультимерам, но распространена гораздо более широко, может встречаться даже в небольших мономерных белках; аллестерический центр, как правило, представлен отдельным центром на поверхности белковой глобулы и топологически независим от активного центра; роль регуляторного агента может выполнять отдельное низкомолекулярное соединение (не субстрат и не кофактор). Более того, были высказаны предположения, что аллостерия в принципе может быть универсальным свойством характерным для большинства глобулярных белков – низкомолекулярное вещество, связавшись в отдельной полости на поверхности белка, в принципе, способно вызвать изменение его конформации (например, затруднить движение функционально важного участка структуры) и таким образом оказать регуляторное влияние – вопрос лишь в том, насколько сильным будет такой эффект, насколько выраженным будет его влияние на функцию.
    (2) Сравнительный биоинформатический анализ каталитических и регуляторных центров (например, Yang 2012 PLoS Comput Biol или Suplatov 2014 Nucleic Acids Res) подтвердили систематические отличия центов разных типов – каталитические центры более консервативны, известные аллостерические центры более вариабельные и содержат специфические позиции, которые могут отвечать за разную специфичность к регуляторному агенту в разных организмах (в том числе – в патогенных бактериях и человеке).
    Таким образом, модуляций функции белка посредством низкомолекулярного регуляторного агента, судя по всему, может быть реализована в большинстве белков (можно искать такие новые центры и комплементарные им лиганды, изучать их влияние на функцию), и такой механизм может быть реализован селективно – например, ингибировать ключевой белок патогенных бактерий, но не человека. Взрывной интерес к изучению аллостерии обусловлен как фундаментальным интересом к поиску новых путей регуляции функциональных свойств белков, так и перспективами использования аллостерических сайтов в качестве мишеней для дизайна лекарственных препаратов с меньшей токсичностью за счет большей селективности связывания и специфичности механизма действия. Необходимо осветить развитие этого направления в современных научных исследованиях.

  • Тема 3: Стабильность как фундаментальный фактор в современной белковой инженерии [тема занята]. Комментарий к теме: Для выполнения своих функций большинство белков образуют компактные структуры, которые стабилизируются сложными сетями ковалентных связей, нековалентными гидрофобными, электростатическими, ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями и водородными связями. Считается, что стабильность является фундаментальным свойством, которое не только влияет на структуру и функцию макромолекул, но и определяет его биологическую «приспособленность»/ «выживаемость». Белки, которые обладают «запасом стабильности» и поэтому лучше переносят функционально полезные, но дестабилизирующие мутации, имеют более высокий шанс пережить давление отбора. Следовательно, дополнительная стабильность ключевых белков может обеспечивать преимущество организма в эволюции, в том числе искуственной эволюции белка в лабораторных условиях, а значит может использоваться при инженерии "улучшенных" ферментов [Bloom JD, Labthavikul ST, Otey CR, Arnold FH (2006) Protein stability promotes evolvability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(15): 5869–5874; Tokuriki N, Stricher F, Serrano L, Tawfik DS (2008) How protein stability and new functions trade off. PLoS Comput Biol 4(2): e1000002]. Необходимо осветить развитие этого направления в современных научных исследованиях.

  • Тема 4: Пакет программ Rosetta как инструмент в белковой инженерии [тема занята]. Комментарий к теме: Пакет программ Rosetta является популярным инструментом компьютерной биологии, который активно используется для решения широкого спектра научных задач, в том числе связанных с белковой инженерией и получением препаратов белков/ферментов с улучшенными свойствами. Необходимо проанализировать современную научную литературу и осветить основние типы задач белковой инженерии, которые решаются с применением этого пакета; базовые принципы, на которых основана работа соответствующих программ (т.е. как это работает), привести примеры успешных работ.

  • Тема 5: Конформационная пластичность структуры белков/ферментов как фундаментальный фактор, влияющий на их функциональные свойства, и учет в современной белковой инженерии [тема занята]. Комментарий к теме: Разработка лекарственных препаратов на основе модуляторов функциональных свойств ферментов и создание эффективных биокатализаторов могут быть упомянуты среди других крупных практически важных задач, успешное решение которых напрямую связано с пониманием тонких деталей механизма действия ферментов, их динамики, а также взаимосвязи структуры и функции. В последние годы в области дизайна лекарств и ферментов с улучшенными свойствами наблюдается четкая тенденция на отказ от неэффективных «стохастических» подходов, основанных на «слепом» скринирования огромных библиотек, в пользу более рациональных и направленных стратегий, которые подразумевают ключевую роль методов биоинформатики и молекулярного моделирования. Методы биоинформатики предоставляют возможность систематически изучать эволюцию интересующих нас признаков и их взаимосвязь со структурой в семействах и суперсемействах белков, что позволяет глубже понять механизм действия ферментов, особенности структурной организации отдельных участков связывания, роль конкретных аминокислотных остатков, их вариативность в определенных фрагментах структуры, участие в образовании сети взаимодействий и влияние на функцию. Несмотря на очевидный прогресс в развитии более эффективных экспериментальных и компьютерных методов в последние годы, они далеко не всегда позволяют решать практически важные задачи: отобранные на стадии скринирования прототипы лекарств часто оказываются неэффективными при последующих испытаниях, а предсказанные на основе компьютерного дизайна мутанты ферментов далеко не всегда обладают желаемыми свойствами и требуют дальнейшего улучшения с использованием стохастической направленной эволюции. Последние исследования говорят о том, что одной из основных причин низкой эффективности существующих методов является представление изучаемых белков в упрощенном виде — на основе единственной статической (кристаллографической) структуры. Структура белка – не статическое образование, она должна быть упорядоченной на определенных этапах выполнения ключевых функций (например, на стадии каталитического превращения субстрата в активном центре фермента), но в то же время достаточно динамичной/гибкой для того, чтобы принимать альтернативные конформации/конфигурации, необходимые на других этапах функционального цикла (распознавании и связывании субстрата, взаимодействии с белками-партнерами, освобождении продуктов и т.д.). Необходимы осветить, как при решении прикладных задач современной белковой инженерии учитывается конформационная пластичность и ее роль в механизмах действия ферментов, динамическом распознавании субстратов/ингибиторов/эффекторов/продуктов.
    Campbell E. et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function //Nature chemical biology. – 2016. – Т. 12. – №. 11. – С. 944; Ganesan A., Coote M. L., Barakat K. Molecular dynamics-driven drug discovery: leaping forward with confidence //Drug discovery today. – 2017. – Т. 22. – №. 2. – С. 249-269; Maria-Solano M. A. et al. Role of conformational dynamics in the evolution of novel enzyme function //Chemical Communications. – 2018.– Т. 54. – С. 6622-6634; Warshel, A. et al. Electrostatic basis for enzyme catalysis // Chemical Reviews, 2006. Т.106. №8. С.3210–3235.

  • Тема 6: Веб-серверы в белковой инженерии. Комментарий к теме: Веб-серверы являются современным стандартом в компьютерной биологии, ориентированным на широкий спектр пользователей. Ключевое преимущество веб-сервера в том, что он является "готовым решением" конкретной вычислительно сложной задачи. Пользователю не нужно закупать и настраивать оборудование, устанавливать и разбираться в комплексных программах. В идеале все, что нужно для использования веб-приложения - нажать на несколько кнопок. Это позволяет использовать сложные методы компьютерной биологии пользователям без соответствующей компетенции и подготовки, например, сотрудникам "мокрых" лабораторий - специалистам в конкретных белках, но не в биоинформатике. Веб-серверы также удобные и для разработчиков, поскольку позволяют не выкладывать в открытый доступ оригинальные программы, потенциально представляющие коммерческую ценность. Таким образом, веб-серверы являются хорошей возможностью для компьютерных биологов предложить свои подходы в максимально удобном виде, создавая таким образом возможность для их использования в повседневной практике сторонних научных коллективов. Нужно проанализировать свежие веб-решения, которые предназначены для использования или уже используются в белковой инженерии.